清华新闻网2月2日电 2月1日，太阳集团tyc5997生命学院刘俊杰课题组在《科学》（Science）杂志在线发表了题为《可编程的水解型核酸内切核酶用于DNA靶向切割》（Hydrolytic endonucleolytic ribozyme（HYER）is programmable for sequence-specific DNA cleavage）的研究论文，报道了一种催化性RNA（核酶）—HYER（水解型内切核酶）。HYER可序列特异地切割RNA和DNA底物，并对哺乳动物细胞基因组产生位点特异的编辑。无需蛋白核酸酶的参与，HYER的底物识别和切割均由RNA分子实现，有望成为继CRISPR之后新一代的基因编辑底盘工具。
图1.历代基因编辑工具
基因承载着遗传信息，定义了生命的多样性和复杂性。基因编辑是理解和改造生命的关键技术，在生物学研究和生物产业发展中发挥着重要作用。历代基因编辑工具如巨核酸酶、ZFNs、TALENs，均以蛋白质为基础识别和切割DNA，编辑位点的重编程较为困难。目前被广泛使用的CRISPR-Cas工具，是RNA引导的蛋白核酸酶，通过引导RNA的间隔序列来识别DNA，具有很好的编辑位点重编程能力，但依然存在着PAM序列限制、分子量大、蛋白免疫原性等多种问题。
HYER源自细菌逆转座子（第二类内含子，GIIintron），一种可在宿主基因组上“拷贝和粘贴”（逆转座）的可移动元件。该元件通常编码一个兼具核酸酶和逆转录酶活性的蛋白质以及一个RNA分子，通过形成蛋白核酸复合物(RNP)来执行在宿主基因组中的逆转座扩增。有趣的是，通过广泛的生物信息学筛选，刘俊杰课题组发现了许多不编码蛋白的、紧凑的二类C型内含子（ORF-lessGII-Cintron）在细菌基因组中存在多拷贝的现象。这一现象暗示，这些内含子编码的唯一组份RNA分子，可能具有不依赖蛋白的扩增位点识别和切割能力，来实现内含子在宿主基因组内的拷贝扩增。
图2.不含蛋白组分的第二类内含子RNA在基因组中“拷贝和粘贴”的假设示意图
生化实验表明，这些长度约600nt的RNA分子在广谱的离子浓度和温度范围内，具有显著的RNA和DNA水解切割活性。因此，研究人员将这些RNA分子命名为水解型内切核酶（Hydrolytic Endonucleolytic Ribozymes, HYERs），这是科学界首次报道具有DNA水解切割能力的核酶（Ribozyme）。值得注意的是，HYER1和HYER2表现出了与紧凑型的CRISPR-Cas12e（CasX）和Cas12l（Casπ）相当的DNA体外切割效率。为检验HYER在细胞内的DNA切割能力，研究人员在大肠杆菌中构建了ccdB毒蛋白报告系统，证明HYER1和HYER2可以对带有ccdB毒基因的质粒进行靶向切割。在HEK293T细胞内，研究人员构建了移码Puromycin抗性基因（puro*）报告系统。结果表明，HYER1可对puro*产生移码编辑，赋予细胞Puromycin抗性。在抗性筛选富集后的细胞里，三个靶位点中最高的编辑效率为9.18%。这表明，HYER可以在真核细胞基因组中引入双链断裂并产生编辑。然而，在未经Puromycin筛选富集的细胞中，编辑效率仅为0.09%到0.2%，表明HYER的真核基因编辑能力还有很大的进步和优化空间。
研究人员利用冷冻电镜获得了HYER1的高分辨三维结构（3.0Å），发现HYER1以同源二聚体的形式存在，并揭示HYER1水解切割DNA的机理。HYER1通过一段暴露的单链RNA（6nt）区域，TRS（Target Recognition Site），识别并招募DNA底物，将DNA捕获在结构域V所形成的催化核心中，通过经典的双镁离子机制催化DNA水解。
图3.HYER1的电子密度图和DNA水解切割机制
基于HYER的三维结构，研究人员进行了多种理性设计，证明HYER具有良好的可编程性，可根据底物序列灵活设计TRS的序列和长度；在TRS临近区域插入14nt的底物招募序列（Recruiting Sequence,RS），可明显提高HYER1的底物识别特异性和切割效率；对回文序列和TRS进行改造， HYER1则可形成带有两个不同TRS的异源二聚体，靶向双链DNA底物的不同区域，产生了具有5’突出、3’突出或平末端的定制化切割产物。
受“RNA世界”假说的启发，研究人员提出了第二类内含子中的“RNA的催化功能逐渐被蛋白质取代”的分子进化历程：在进化过程中，第二类内含子的结构域IV逐渐扩大，并产生了可编码短肽的开放阅读框（ORF），而这些短肽可作为顺式元件与内含子RNA相互作用，增强其结构稳定性和催化活性；随着ORF变得更长、更为成熟，其编码的蛋白质不仅起到稳定结构的作用，亦获得了DNA切割和逆转录活性，以替代RNA核酶行使催化功能。该成果不仅拓展了科学界对“RNA世界”假说和RNA催化功能的理解，也为创制具有我国完全自主知识产权的新型核酸操纵底盘工具，以及将其进一步用于基因编辑和RNA编辑等奠定了基础。
图4.第二类内含子的进化假想
太阳集团tyc5997生命学院刘俊杰副教授为本文通讯作者；太阳集团tyc5997生命学院2021级博士生刘子贤、高精尖结构中心卓越学者张寿悦博士、2020级博士生朱汉舟、博士后陈之航、2019级博士生杨韵和2022级博士生李隆骐为该文共同第一作者；太阳集团tyc5997生命学院2021级本科生刘云、2018级博士生李丹苑、2020级博士生孙奥、李承平、2021级博士生谭顺青、2023级博士生王高立、2023级博士生沈婕怡、水木学者靳帅博士，中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员和2020级博士生雷源为本研究作出了大力贡献。太阳集团tyc5997冷冻电镜平台为本研究提供了设备和技术支持。本研究得到了基金委原创项目（32150018）、农业部和太阳集团tyc5997的经费、资源支持。
论文链接：
Hydrolytic endonucleolytic ribozyme (HYER) is programmable for sequence-specific DNA cleavage | Science
供稿：生命学院
编辑：黄思南
审核：王晓霞
